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流感爆发!儿童呼吸道检测方法大汇总!

时间:2019-12-17打印本文

流感季来了,各大医院最繁忙的莫过于急诊科和儿科,而呼吸道相关病原体的检测一直是IVD领域的一大细分市场。


儿童急性呼吸道感染是常见疾病,分为上呼吸道感染和下呼吸道感染


急性上呼吸道感染:以急性鼻咽炎为主要表现的普通感冒、急性鼻窦炎、扁桃体炎、喉炎、咽炎、会厌炎等。


急性下呼吸道感染:急性气管支气管炎、细支气管炎、肺炎,其中肺炎是5岁以下儿童死亡的最主要原因。

常见病原体: 

病毒、细菌、肺炎支原体、肺炎衣原体等。

样本类型:

上呼吸道标本:口咽拭子、鼻咽拭子(NPS)、鼻咽吸取物(NPA)


下呼吸道标本:痰液、气管吸取物、支气管肺泡灌洗液等


采集前准备:

  • 收集器和容器

需经过压力蒸汽法等物理灭菌、不含有核酸酶、预装有防核酸降解功能的保存液等


  • 病毒运输液

除分子诊断外,易干燥的病毒样本(鼻咽拭子)必须采用病毒运输液或其他相应的缓冲液保存样本,以维持病毒颗粒的效价和病毒抗原的稳定。


  • 采集部位

多数呼吸道病毒的主要感染复制部位为后鼻咽部纤毛柱状上皮细胞,其次为前鼻孔和口咽部纤毛上皮细胞,因此,鼻咽拭子的病原检出率较口咽拭子高。


  • 采样拭子材质

植绒拭子可吸附更多的生物样本并可达到较高的释放率。植绒材料应该为聚酯纤维或聚酰胺纤维,均不应含藻酸钙,尼龙纤维制成的植绒拭子能收集到更多的呼吸道上皮细胞。


聚氨酯纤维相比尼龙和涤纶拭子更适合用于采集过程中较易出血的患儿。


普通木柄的棉拭子可能含有对细胞培养有害的物质,且常不能采集到足够量的脱落细胞,不适用于鼻咽或口咽部分泌物的采集。

  •    样本类型

鼻咽吸取物

鼻咽吸取物较咽拭子有更高的阳性检出率,可用于病毒核酸和病毒抗原检测。

支气管肺泡灌洗液 

患儿在静脉麻醉或气道局部麻醉后,导入支气管镜。病变局限者选择病变段,弥漫者选择右肺中叶或左肺舌叶。

痰液

适合于病毒核酸和病毒抗原检测。

气管吸取物

有气管插管或气管切开等人工气道的患儿无法自行咳痰,可通过吸痰管从气道吸取标本

血清标本 

血液采集要遵循医疗规范,应尽可能采集急性期和至少间隔2 周的恢复期血清,要注意防止标本溶血。

保存条件

  • 室温下 30 min 内送检。

  • 2-4℃ 24 h 内送检,不宜超过48h。

  • 24 h以上送检, -70℃条件下保存

  • 用于病毒分离的样本不推荐低温冷冻(≤-70℃)。同时标本应避免反复冻融。

常见的实验室检测方法

病毒分离培养

经典病毒分离培养方法有动物培养、鸡胚培养和组织细胞培养。


优势:操作相对简单且成本较低,呼吸道病毒分离培养是病毒检测的金标准。


劣势:培养周期较长,检测环节较多,操作不易标准化,对人员技术要求较高,不适合临床开展。

病毒抗原检测

原理:病毒抗原和特异性抗体相互结合,快速检测临床标本中的病毒抗原。


种类:直接或间接免疫荧光法、放射免疫法、酶联免疫法、胶体金免疫分析、免疫层析法等。


优势:呼吸道病毒抗原检测特异度较好,阳性提示活动性病毒感染。


劣势:灵敏度较低,需要采集到足够量的呼吸道上皮细胞,因此阴性不能排除相关的病毒感染,此外污染的黏液可产生非特异性荧光,需要经验丰富的实验技术人员进行判断。


核酸检测

原理:呼吸道标本中提取病毒核酸,利用病毒基因特异的寡核苷酸作为引物,加入热稳定的核酸聚合酶,在合适温度下对病毒的特异基因片段进行重复扩增,采用多种不同的方法检测病毒特异性的扩增产物。


种类:聚合酶链反应(PCR)、单目标终点法、巢式PCR、实时PCR 、定量PCR、多重PCR 、环介导等温扩增技术(LAMP) 、基因芯片技术、Sanger 测序技术、焦酸测序技术和二代测序技术等。


优势:快速、简便、高通量、高敏感度及高特异度


劣势:潜在的残留污染和交叉污染,存在核酸检测假阳性的可能,且部分病毒核酸检测阳性(如鼻病毒、肠道病毒和冠状病毒等)不能确定是否为现症感染,要结合流行病学、临床特征及血清抗体检测等综合判断。


病毒直接检测

原理:通过电子显微镜可直接观察到呼吸道标本中病毒的典型特征形态


优势:成本低廉,结果易读。


劣势:要求标本中有大量的病毒(108~109/L)才能检测到,需要有经验的技术人员和昂贵的电子显微镜设备,操作复杂,技术要求高,不适宜用于呼吸道病毒感染的临床诊断。


血清抗体检测

原理:机体对病毒入侵作出应答或通过免疫反应可检测到抗体。


种类:补体结合试验、血凝抑制试验、中和试验、免疫黏附血凝试验等。


优势:IgM 有短暂出现的特点,它的出现表明感染发生于当前或近期,IgG 在一段时间内显著升高也可作为现症感染的依据。


劣势:婴幼儿可因免疫反应较弱而出现假阴性,对儿童呼吸道病毒早期诊断的价值有限。

来源:IVD从业者

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